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通常轉錄發生在生物體內,如果我們將含有RNA轉錄酶、NTP等條件,在體外無細胞系統中,用DNA作為模板,模仿體內轉錄過程生成RNA,這樣的技術則能夠控制轉錄的基因、轉錄的過程和轉錄后RNA的用途,該技術被稱為體外轉錄。

1 體外轉錄 -基本信息

中文名稱:
體外轉錄 
英文名稱:
in vitro transcript

2 體外轉錄 -概述

 在試管中對一個結構基因5′一端加上啟動子,3′端加終止子在四種核苷三磷酸存在下經RNA聚合酶作用即可以結構基因為樣板進行轉錄,合成RNA。

3 體外轉錄 -定義

定義1:在含有RNA轉錄酶、必要的蛋白質因子、核苷三磷酸等條件的體外無細胞系統中,用DNA作為模板,模仿體內轉錄生成RNA的技術。 

應用學科:生物化學與分子生物學(一級學科);方法與技術(二級學科)

 定義2:在無細胞系統中進行的轉錄。

 應用學科:遺傳學(一級學科);分子遺傳學(二級學科) 

4 體外轉錄 -步驟

一共分為三個步驟,即變性、退火、延伸。
1、變性,這個步驟是利用高溫使DNA由雙螺旋結構解旋成為兩條單鏈。原理是使每一個鹼基對的所有氫鍵打開。通常在93攝氏度的溫度下進行
2、退火,首先將完成第一步的DNA降溫(也就是為什麼叫它退火的原因)至73攝氏度(不同DNA溫度不同,但大致就是這個範圍),這個時候會有引物與單鏈DNA結合,並準備配合各種RNA及各種酶來完成DNA的複製。
3、延伸,這個過程就是上面說到的DNA複製的過程。完成之後,原來的一段DNA就變成了現在的兩段了。

5 體外轉錄 -過程

在體外轉錄時, 可以將要轉錄的 DNA片段克隆到轉錄載體的多克隆位點上,而在多克隆位點的附近必須有 SP6、T7或 T3 RNA聚合酶的啟動子序列。目前多用線性化質粒作為體外轉錄的模板。 經凝膠回收純化的含有RNA聚合酶啟動子序列的PCR產物也可以作為轉錄模板。通常PCR產物需要測序確定后,才進行體外轉錄。另外cDNA也可以作為模板。

在底物中(NTP)加入適量的生物素或者地高辛標記的NTP,則所轉錄的RNA可得到高效標記,即可作為RNA探針,做Northern 雜交等。 或者利用RT-PCR技術方法擴增出病毒全長cDNA,克隆入帶有SP6或者T7 RNA聚合酶啟動子質粒,以此全長cDNA為模板做體外轉錄,轉錄產物轉染細胞后觀察到了典型的病毒病變,從而判定病毒的侵染性。抑或獲得干擾RNA和核酶。 
 
Roche的體外轉錄試劑盒(SP6/T7 Transcription Kit),是一款雙系統(SP6/T7)的盒子,SP6和T7每個系統可以做20次(標準的20ul反應體系),並且提供pSPT18和pSPT19空載體,以及線性化的對照DNA模板(pSPT18和pSPT19的混合液),在轉錄時間上只需要85 min。

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