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  腺相關病毒(AAV)是一個常見的人細小病毒,自然缺陷、無包被和無致病原性。AAV複製周期由兩個明顯的階段構成:潛伏期和增殖期。在缺少輔助病毒諸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、皰疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒條件下(Yakobson等,1989),AAV能複製產生子代病毒顆粒。在缺少輔助病毒的情況下,腺相關病毒整合其基因組到19號染色體的一個特別位點並保持整合直到隨後的輔助病毒將其從潛伏狀態下拯救出來(Kotin等,1990)。AAV的位點特異性的整合能力、其自然缺陷以及其無致病原性使其成為基因治療載體成為可能。重組AAV(rAAV)載體能轉導培養細胞以及體內不同組織比如肺(Flotte等,1993;Conrad等,1996;Halbert等,1997)、腦(Kaplitt等,1994)、肌肉(Xiao等,1996)、視網膜(Ali,1996;Flannery等1997)、中樞神經系統(Peel等,1997)和肝(Xiao等,1998)。
  AAV基因組是一個線性、單鏈(ssDNA)分子,4680個核苷酸,在每個末端含有一個145個鹼基末端重複序列(TR)(Srivastava等,1983)。TR序列摺疊成發卡結構作為DNA複製起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的唯一已知順式作用元件。TR元件位於兩個翻譯開放閱讀框(ORF)的兩側。左側ORF(或rep基因)編碼四個非結構蛋白質稱為Rep78、68、52和40,對於病毒DNA複製和包裝是關鍵性的。右側的ORF(或cap基因)編碼三個結構蛋白質VP1、VP2和VP3(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)。
  重組腺病毒載體(rAAV)的構建通常涉及rep和cap基因的剔除和將感興趣的轉基因插入TR元件之間。產生的載體質粒隨後與一個表達AAV的rep和cap基因的包裝質粒一起共轉染到組織培養細胞中。質粒轉染的組織培養細胞被感染Ad以提供輔助功能以有效複製AAV和基因表達。幾天後收穫培養物,並利用柱層析或多輪超速離心純化rAAV。60°C加熱滅活任何殘留的Ad。關鍵的Ad輔助基因包括:E1a轉錄激活Ad以及AAV基因,E1b和E4編碼增進mRNA裝運到細胞質的蛋白質,E2a表達一個ssDNA結合蛋白質促進AAV
  DNA複製,VAI RNA基因生成一個小RNA轉錄物增進AAV capsid mRNA的翻譯。
  此繁瑣過程的局限性阻止了rAAV廣泛發展為基因治療的載體。如上所述載體的生成總是導致載體的明顯Ad污染,因此需要熱處理和嚴格的純化方法滅活和去除Ad病毒顆粒污染。儘管載體和包裝質粒之間通常沒有同源序列,但是經常產生野生型樣有複製能力的AAV(rcAAV)(Allen等,1997;Wang等,1998)。已經進行了許多嘗試改進rAAV載體的包裝效率。它們包括:發展表達一些或所有包裝所需的AAV基因的細胞系(Yang等,1994;Clark等,1995;Tamayose等,1996;Inoue和Russell,198),構建Ad輔助質粒能夠用來替代Ad感染(Matsu***a等,1998;Xiao等,1998b)和發展重組Ad攜帶rAAV載體基因組(Gao等,1998)。
  我們已經構建了新的輔助質粒,完全不用在rAAV包裝過程中感染Ad。這些質粒含有Ad基因組的VA、E2a和E4基因以及AAV的rep和cap基因。當轉染到含有Ad5E1a和E1b基因的人293細胞中,輔助質粒提供了一個有效的、無Ad污染的包裝系統。我們用此新系統所產生的rAAV滴度與大多pAAV/Ad包裝質粒(Samulski等,1989)相比提高了80倍。另外,Ad再也不能產生,有複製能力的AAV在任何載體製備過程中尚未發現。

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