標籤:現代生物科技DNA的結構

DNA重組(DNA recombination)指DNA分子內或分子間發生的遺傳信息的重新共價組合過程。包括同源重組、特異位點重組和轉座重組等類型,廣泛存在於各類生物。體外通過人工DNA重組可獲得重組體DNA,是基因工程中的關鍵步驟。

1DNA重組技術連接反應

外源DNA和質粒載體的連接
外源DNA片段和線狀質粒載體的連接,也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸,可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化,則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口(圖1.8),當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化,這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中,T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因為在下述反應條件下,它就能有效地將平
DNA重組
端DNA片段連接起來。
DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應,在標準條件下,其反應速度完全由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位於同一DNA分子(分子內連接)還是位於不同分子(分子間連接),都是如此。現考慮一種簡單的情況,即連接混合物中只含有一種DNA,也就是用可產生粘端的單個限制酶切割製備的磷酸化載體DNA。在加作用的底物。如果反應中DNA濃度低,則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大(因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高於找到不同DNA分子的末端的概率)。這樣,在DNA濃度低時,質粒DNA重新環化將卓有成效。如果連接反應中DNA濃度有所增高,則在分子內連接反應發生以前,某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時,連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷,第2、3期合刊)從理論上探討了DNA濃度對連接產物性質的影響。簡而言之,環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決於兩個參數:j和i。j是DNA分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度,j的數值是根據如下一種假設作出的:沉吟液中的DNA呈隨機捲曲。這樣,j與DNA分子的長度成反比(因為DNA越長,某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用),因此j對給定長度的DNA分子來說是一個常數,與DNA深度無關。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA長度,以cm計,b是隨機捲曲的DNA區段的長度。b的值以緩衝液的離子強度為轉移,而後者可影響DNA的剛度。
i是溶液中所有互補末端的深度的測量值,對於具有自身互補粘端的雙鏈dna而言,i=2NoMx10-3末端/ml這裡No是阿佛伽德羅常數,M是DNA的摩爾濃度(單位:mol/L)。理論上,當j=i時,給定DNA分子的一個末端與同一分子的另一末端,以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下,在反應的初始階段中,環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時,有利於重新環化;當i>j,則有利於產生多聯體。圖1.9顯示了DNA區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需DNA濃度之間關係(Dugaiczyk等,1985)。現在考慮如下的連接反應混合物:其中除線狀質粒之外,還含有帶匹配末端的外源DNA片段。對於一個給定的連接混合物而言,產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響,而且還受質粒和外源DNA末端的相對濃度的影響。當i是j的2-3倍(即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求,而又不致引起大量寡聚體分子的形成時)外源DNA末端濃度的2倍時,有效重組體的產量可達到最大。這些條什下,連接反應終產物的大約40%都是由單體質粒與外源DNA所形成的嵌合體。當連接混合物中線性質粒的量恆定(j:i=3)而帶匹配末端的外源DNA的量遞增時,這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。
涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒DNA的連接反應應包含:
1)足量的載體DNA,以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒,這意味著連接反應中應含有載體DNA為20-60μg/ml。
2)末端濃度等於或稍高於載體DNA的外源DNA,如外源DNA濃度比載體低得多,在效連接產物的數量會很低,這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下,可考慮採用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒DNA或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。

2粘端連接

1)用適當的限制酶消化質粒和外源DNA。如有必要,可用凝膠電泳分離片段並(或)用鹼性磷酸酶處理質粒DNA。通過酚:氯仿抽提和乙沉澱來純化DNA,然後用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
2)按如下所述設立連接反應混合物:
a.將0.1μl載體DNA轉移到無菌微量離心管中,加等摩爾量的外源DNA。
b.加水至7.5μl,於45℃加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈,將混合物冷卻到0℃。
c.加入:10xT4噬菌體DNA連接酶緩衝液 1μl
T4噬菌體NDA連接酶 0.1Weiss單位
5mmol/L ATP 1μl
於16℃溫育1-4小時
10xT4噬菌體DNA連接酶緩衝液
200mmol/L同Tris&nbsp;Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(組分V.Sigma產品)(可用可不用)
該緩訓液應分裝成小份,貯存於-20℃。
另外,再設立兩個對照反應,其中含有(1)只有質粒載體;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每個連接反應可用50-100ng質粒DNA,並儘可能多加外源DNA,同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數製造廠商(除New England Biolabs公司外)現在都用Weiss等,11968)對該酶進行標化。1個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化1mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時,1個Weiss單位相當於0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位(Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位(如New England Biolabs公司所定義)。因此,0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶在16℃下30分鐘內可使50%的λ噬菌體HindⅢ片段(5μg)得以連接。在本書中,T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液(1-5單位/μl),可用20mmol/L (pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處於這種濃度並在這種緩衝液中的T4噬體DNA連接酶於-20℃保存3個月可保持穩定。
3)每個樣品各取1-2μl轉化大腸桿菌感受態細胞。

3平端DNA連接

T4噬菌體DNA連接酶不同於大腸桿菌DNA連接酶,它可以催化平端DNA片段的連接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由於DNA很容易成為平端,所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性,才能使任何DNA分子彼此相連。然而,相對而言,平端連接是低效反應,它要求以下4個條件:
1)低濃度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2)不存在亞精胺一類的多胺。
3)極高濃度的連接酶(50Weiss單位.ml)。
4)高濃度的平端。
1.凝聚劑
在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用並可導致DNA分子凝聚成集體的物質,如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高鈷(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得適當濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應中,這些物質具有兩作用:
1)它們可使平端DNA的連接速率加大1-3個數量級,因此可使連接反應在酶DNA濃度不高的條件下進行。
2)它們可以改變連接產物的分佈,分子內連接受到抑制,所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣,即使在有利於自身環化(j:i=10)的DNA濃度下,所有的DNA產物也將是線狀多聚體。\par 在設立含凝聚劑的連接反應時,下列資料可供參考。
(1)聚乙二醇(PEG8000)
1)用去離子水配製的PEG8000貯存液(40%)分裝成小份,冰凍保存,但加入連接反應混合物之前應將其融化並使其達到室溫。在含15%PEG 8000的連接反應混合物中,對連接反刺激效應最為顯著。除PEG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外,其他所有連接混合物的組分應於0℃混合,然後加適當體積的PEG 8000(處於室溫),混勻,加酶後於20℃進行溫育。
2)連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應最為顯著,甚至ATP濃度略有增加或MgCl2濃度略有降低,都會嚴重降低刺激的強度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3)濃度為15%的PEG 8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來的10-100倍,反應的主產物是串聯的多聯體。
4)PEG 8000可刺激短至8個核苷酸的合成寡聚物的平端連接,在這一方面,它與氯化六氨合高鈷有所不同。
(2)氯化六氨合高鈷
1)氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存於-20℃,它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時,其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部,但只能使端連接的效率提高到原來的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。
2)在單價陽離子(30mmol/L KCl)存在下,它對平端連接仍有一定的刺激作用,但此時連接產物的分佈有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物,相反,環狀DNA將點盡優勢。
3)與PEG 8000不同,氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。

4質粒載體中的快速克隆

質粒克隆中最慢的步驟是所需的外源DNA片段和相應質粒DNA區段的電泳純化,下面的操作方案[由S.Michaelis(個人通訊)根據Struhl(1985)的方法修訂而成]是從純化的凝膠中回收瓊脂糖塊,熔化后直接進行質粒和外源DNA的連接。這一方法尋平端連接和粘端連接都同樣奏效,但需大量的連接酶,而且效率要比標準操作方案約低一個數量級。
1)用適當的限制酶消化外源DNA,其量應足以產生約0.2μg的靶片段。反應體積應為20μl或更小。在另一管中,用相應的限制酶消化約0.5μg載體DNA,總反應體積為20μl或更小。如載體DNA帶相同的端,應用磷酸處理如下:用限制酶消化完全后,加2.5μl 100mmol/L (pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25單位牛小腸鹼性磷酸酶,於37℃溫育30分鐘。
2)通過瓊脂糖凝膠電泳分離目標片段。務必用低熔點瓊脂糖灌制凝膠,務必用含溴化乙錠(0.5μg/ml)的1xTAE作為電泳緩衝液而不是常規的0.5xTBE來配製凝膠並進行電泳。
3)在長波長紫外照射下檢查凝膠,根據目標條帶的相對熒光強度估計所含DNA的量(見附錄E)。用刀片切出目標條帶,儘可能少瓊脂糖的體積(通常40-50μl)。將切下凝膠片分別放入作好標記的各個微量離心管中。
4)於70℃加熱10-15分釧,使瓊脂糖熔化。
5)合併熔化的小份凝膠並放到加溫至37℃的中一管中,共終體積應不超過10μl,外源DNA與質粒載體的摩爾比應接近2:1。
用另外兩個管設立兩個對照連反應,一個只含質粒載體,另一個只含外源DNA片段。
6)將3個管於37℃溫育5-10分鐘,然後每管加10μl用冰預次的2xT4噬體DNA連接酶混合物,在瓊脂糖凝固前,充他混勻各管內容物,於16℃溫育12-16小時。
2xT4噬菌體DNA連接酶混合物可製備如下:
1mol/L <cite class="highlight" highlight="true"></cite>(pH7.6) 1.0μl
100mmol/L氯化鎂 1.0μl
200mmol/L三硫蘇糖醇 1.0μl
10mmol/L ATP 1.0μl
水 5.5μl
T4噬菌體DNA連接酶 1Weiss單位
混勻後放置於冰浴上。
7)連接反應行將結束時,取出貯存於-70的3管各200μl的凍存大腸桿菌感受態細胞
8)於70℃中熱10-15分鐘重新溶化連接混合物中的瓊脂糖。
9)立即從每管連接混全物中取出5μl加到200μl大腸桿菌感受態細胞中,小心搖晃,快速地混勻內容物。從剩下每管連接混合物中分別再取5μl重複以上步驟,將轉化混合物在冰浴上放置30分鐘。
10)完成轉化方案的其餘各步。

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