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Folin-酚法:(Lowry法)這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法,由於其試劑乙的配製較為困難,近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。

1 Folin-酚法 -Folin—酚試劑法(Lowry法)

  

2 Folin-酚法 -(一)實驗原理



這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法,由於其試劑乙的配製較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是:?在鹼性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾Lowry反應。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩衝液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色後會色淺,則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

進行測定時,加F olin—酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定,但上述還原反應只在pH=10的情況下發生,故當Folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前,還原反應即能發生。

此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。

此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定範圍是20~250mg。

3 Folin-酚法 -(二)試劑與器材


1.試劑

(1)試劑甲:

(A) 10克 Na2CO3,2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6·4H2O)。溶解於500毫升蒸餾水中。

(B) 0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解於100毫升蒸餾水中,每次使用前,將50份(A)與1份(B)混合,即為試劑甲。

(2)試劑乙:

在2升磨口迴流瓶中,加入100克鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸餾水,再加50毫升85%磷酸,100毫升濃鹽酸,充分混合,接上迴流管,以小火迴流10小時,迴流結束時,加入150克 硫 酸 鋰(Li2SO4),50毫升蒸餾水及數滴液體溴,開口繼續沸騰15分鐘,以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色,須再重複滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升,過濾,濾液置於棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定,酚酞作指示劑,然後適當稀釋,約加水1倍,使最終的酸濃度為1N左右。

(3)標準蛋白質溶液:

精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白,溶於蒸餾水,濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶於水若混濁,可改用0.9 % NaCl溶液。

2. 器材

(1)可見光分光光度計 (2)旋渦混合器 (3)秒錶 (4)試管16支

(三)操作方法

1. 標準曲線的測定:取16支大試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其餘試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升標準蛋白質溶液(濃度為250mg/ml)。用水補足到1.0毫升,然後每支試管加入5毫升試劑甲,在旋渦混合器上迅速混合,於室溫(20~25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑),同樣立即混勻。這一步混合速度要快,否則會使顯色程度減弱。然後在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,於700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪製出標準曲線。

注意:因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深,因此各項操作必須精確控制時間,即第1支試管加入5毫升試劑甲后,開始計時,1分鐘后,第2支試管加入5毫升試劑甲,2分鐘后加第3支試管,余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘,則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙,1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙,2分鐘后加第3支試管,余此類推。待最後一支試管加完試劑后,再放置30分鐘,然後開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。

進行多試管操作時,為了防止出錯,每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量(毫升),並按由左至右,由上至下的順序,逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量(微克)和測得的吸光度值。

2. 樣品的測定:取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質20~250微克),按上述方法進行操作,取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起,同時進行。即在標準曲線測定的各試管後面,再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。

根據所測樣品的吸光度值,在標準曲線上查出相應的蛋白質量,從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。

注意,由於各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用於測定蛋白質的相對濃度(相對於標準蛋白質)。

Folin-酚法測定蛋白質含量

原理:磷鉬酸和磷鎢酸在鹼性條件下,易被酚類化合物還原而呈藍色反應.蛋白質中含有代酚基的酪氨酸,故有此反應.Folin---酚法的靈敏度是雙縮脲法的100倍.

試劑:一:1,4%碳酸鈉;2,0.2N氫氧化鈉;3,1%硫酸銅;4,2%酒石酸鉀鈉。1和2等體積混合,3和4等體積混合,然後將兩液以50:1混合(甲)。當天使用。二:1NFolin--酚試劑(乙)。

方法:標準曲線;試管中加0、0.2、0.40、0.60、1.00毫升酪蛋白溶液(500微克/毫升),加水補足1毫升,平行做兩份。按序各加5毫升試劑(甲),搖勻,室溫置放10分鐘,再依次加入1N(0.5毫升)Folin----酚試劑(乙),搖勻,30攝氏度保溫30分鐘。然後在分光光度機上比色測定(A500)。待測樣品如上反應和測定,對照標準曲線,得出含量。

注意:酚和檸檬酸對測定有干擾,低濃度尿素,胍,硫酸鈉,硝酸鈉,三氯乙烯,乙醇,乙醚,丙酮對顯色無影響。

4 Folin-酚法 -其它

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