評論(0

SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳

標籤:方法與技術

SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳技術首先在1967年由Shapir0建立,其原理:聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺(簡稱Acr)和交聯劑N,N』一亞甲基雙丙烯醯胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸鉸(AP),N,N,N』,N』 四甲基乙二胺(TEMED)作用下,聚合交聯向成的具有網狀立體結構的凝膠,並以此為支持物進行電泳。

1簡介

SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳技術首先在1967年由Shapir0建立,1969年由weber和Osborn進一步完善。

2電泳原理

SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳原理
聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺(簡稱Acr)和交聯劑N,N』一亞甲基雙丙烯醯胺(簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(AP),N,N,N』,N』 四甲基乙二胺(TEMED)作用下,聚合交聯向成的具有網狀立體結構的凝膠,並以此為支持物進行電泳。
聚丙烯醯胺凝膠電泳可根據不同蛋白質分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產生的不同遷移率將蛋白質分離成若干條區帶,如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質,蛋白質樣品電泳后,就應只分離出一條區帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵,並按一定的比例和蛋白質分子結合成複合物,使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷,掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此,各種蛋白質 SDS複合物在電泳時的遷移率,不再受原有電荷和分子形狀的影響,只是棒長的函數。這種電泳方法稱為SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(簡稱SDS—PAGE)。由於SDS PAGE可設法將電泳時蛋白質電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度,因此常用來鑒定蛋白質分離樣品的純化程度,如果被鑒定的蛋白質樣品很純,只含有一種具三級結構的蛋白質或含有相同分子量亞基的具四級結構的蛋白質,那麼 SDS—PAGE后,就只出現一條蛋白質區帶。SDS—PAGE可分為圓盤狀和垂直板狀、連續系統和不連續系統。本實驗採用垂直板狀不連續系統。所謂「不連續」是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩衝液、pH和凝膠孔徑等所組成。

3特性

(1)在一定濃度時,凝膠透明,有彈性,機械性能好;
(2)化學性能穩定,與被分離物不起化學反應,在很多溶劑中不溶;
(3)對pH和溫度變化較穩定;
(4)幾乎無吸附和電滲作用,只要Acr純度高,操作條件一致,則樣品分離重複性好;
(5)樣品不易擴散,且用量少,其靈敏度可達10-6g
(6)凝膠孔徑可調節,根據被分離物的分子量選擇合適的濃度,通過改變單體及交聯劑的濃度調節凝膠的孔徑;
(7)解析度高,尤其在不連續凝膠電泳中,集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的解析度。

4實驗步驟

1.樣品的濃縮效應
往不連續電泳系統中,含有上、下槽緩衝液(Tris—Gly,pH8.3)、濃縮膠緩衝液(Tri s—HCl,pH6.8)、分離膠緩衝液(Tri s—HCl, pH8.8),兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同。在這種條件下,緩衝系統中的HCl幾乎全部解離成Cl一,兩槽中的Gly(pI一6.0,pK a=9.7) 只有很少部分解離成Gly的負離了,而酸性蛋白質也可解離出負離子。這些離子存電泳時都向正極移動。Cl一速度最快(先導離子),其次為蛋白質,Gly負離了最慢(尾隨離了)。南於C1一很快超過蛋白離子,因此存其後面形成一個電導較低、電位梯度較陡的區域,該區電化梯度最高,這是在電泳過程中形成的電化梯度的不連續性,導致蛋白質和G1y離子加快移動,結果使蛋白質存進入分離膠之前,快、慢離子之間濃縮成一薄層,有利於提高電泳的解析度。
2.分子篩效應
蛋白質離子進入分離膠后,條件有很人變化。由於其pH升高(電泳進行時常超過9.0),使Gly解離成負離子的效應增加;同時因凝膠的濃度升高,蛋白質的泳動受到影響,遷移率急劇下降。此兩項變化,使Gly的移動超過蛋白質,上述的高電壓梯度不復存在,蛋白質便在一個較均一的pH和電壓梯度環境中,按其分子的大小移動。分離膠的孔徑有一定的大小,對不同相對分子質量的蛋白質來說,通過時受到的阻滯程度不同,即使凈電荷相等的顆粒,也會由於這種分子篩的效應,把不同大小的蛋白質相百分開。

5注意事項

1.SDS與蛋白質的結合按質量成比例(即:1.4g SDS /g蛋白質),蛋白質含量不可以超標,否則SDS結合量不足。
2.用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質相對分子量時,必須同時作標準曲線。不能利用這次的標準曲線作為下次用。並且sDs—PAGE 測定分子量有10%誤差,不可完全信任。
3.有些蛋白質由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上肽鏈(Q一胰凝乳蛋白酶)組成的,它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此,對丁這一類蛋白質,SDS一聚內烯醯胺凝膠電泳法測定的只是它們的相對分子量。
4.有的蛋白質(如:電荷異常或結構異常的蛋白質;帶有較大輔基的蛋白質)不能採用該法測相對分子量。
5.如果該電泳中出現拖尾、染色帶的背景不清晰等現象,可能是SDS不純引起。

相關評論

同義詞:暫無同義詞