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1HE染色介紹

蘇木精 — 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ,簡稱HE染色法 ,石蠟切片技術里常用的染色法之一 。蘇木精染液為鹼性 ,主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色 ;伊紅為酸性染料 ,主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色 。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術方法。

2染色分類

易於被鹼性或酸性染料著色的性質稱為嗜鹼性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia );而對鹼性染料和酸性染料親和力都比較弱的現象稱為中性(neutrophilia)。
組織內的蛋白質構成蛋白質的氨基酸的種類很多,它們有不同的等電點。在普通染色法中,染色液的酸鹼度為pH6左右,細胞內的酸性物質如細胞核的染色質、腺細胞和神經細胞內的粗面內質網及透明軟骨基質等均被鹼性染料染色,這些物質稱為嗜鹼性。而細胞質中的其它蛋白質如紅細胞中的血紅蛋白、嗜酸粒細胞的顆粒及膠原纖維和肌纖維等被酸性染料染色,這些物質稱為嗜酸型。如果改變染色液的酸鹼度,pH值升高時,則原來被酸性染料染色的物質可變為嗜鹼性;pH值降低時,原來被鹼性染料染色的物質則可變為嗜酸性。所以說染色液的pH值可以影響染色的反應。
脫氧核糖核酸(DNA)兩條鏈上的磷酸基向外,帶負電荷,呈酸性,很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性染料以離子鍵結合而被染色。蘇木精在鹼性溶液中稱藍色,所以細胞核被染成藍色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料,在水中離解成帶負電荷的陰離子,與蛋白質的氨基正電荷的陽離子結合使胞漿染色,細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色,與藍色的細胞核形成鮮明對比。伊紅是細胞漿的良好染料。
由於組織或細胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質不一樣。經蘇木精染色后,細胞核及鈣鹽粘液等呈藍色,可用鹽酸酒精分化和弱鹼性溶液顯藍,如處理適宜,可使細胞核著清楚的深藍色,胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿,使胞漿的各種不同成分又呈現出深淺不同的粉紅色。故各種組織或細胞成分與病變的一般形態結構特點均可顯示出來。

3染色結果

細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色,軟骨基質、鈣鹽顆粒呈深藍色,粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色,胞漿內嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色,彈力纖維呈亮粉紅色,紅血球呈橘紅色,蛋白性液體呈粉紅色。
著色情況與組織或細胞的種類有關,也隨其生活周期及病理變化而改變。例如,很多細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜鹼,當其衰老時或發生退行性變則呈現嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現透明變性時,伊紅著色由淺變深。

4常規HE染色步驟

染色流程
(1)二甲苯(Ⅰ) 15min
(2) 二甲苯(Ⅱ) 15 min
(3)二甲苯:無水乙醇=1:1 2min
(4)100%乙醇(Ⅰ) 5min
(5)100%乙醇(Ⅱ) 5 min
(6)80%乙醇 5min
(7)蒸餾水 5 min
(8)蘇木精液染色 5 min
(9) 流水稍洗去蘇木精液 1-3 s
(10) 1%鹽酸乙醇 1-3 s
(11) 稍水洗 10-30 s
(12)蒸餾水過洗 1-2 s
(13) 0.5%伊紅液染色 1-3 min
(14) 蒸餾水稍洗 1-2 s
(15) 80%乙醇稍洗 1-2 s
(16) 95%乙醇(Ⅰ) 2-3 s
(17) 95%乙醇(Ⅱ) 3-5 s
(18) 無水乙醇 5-10 min
(19) 石炭酸二甲苯 5-10 min
(20) 二甲苯(Ⅰ) 2 min
(21) 二甲苯(Ⅱ) 2 min
(22) 二甲苯(Ⅲ) 2 min
(23) 中性樹膠封固
註:①第(11)、(12)步可省去,(13)步沖水時間需延長至20-30min。
②第(21)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用無水乙醇。
* 冷凍切片HE染色步驟:
(1)冰凍切片固定 10~30 s
(2)稍水洗 1~2 s
(3)蘇木精液染色(60℃) 30~60 s
(4)流水洗去蘇木精液 5~10 s
(5)1%鹽酸乙醇 1~3 s
(6)稍水洗 1~2 s
(7)促藍液返藍 5~10 s
(8)流水沖洗 15~30 s
(9)0.5%曙紅液染色 30~60 s
(10)蒸餾水稍洗 1~2 s
(11)80%乙醇 1~2 s
(12)95%乙醇 1~2 s
(13)無水乙醇 1~2 s
(14)石炭酸二甲苯 2~3 s
(15)二甲苯(Ⅰ) 2~3 s
(16)二甲苯(Ⅱ) 2~3 s
(17)中性樹膠封固。
註:第(14)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用無水乙醇。
染色結果:細胞核藍色,胞質、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈深淺不一的紅色。
4.12 切片脫水透明 切片經HE染色后,要徹底脫水透明,才能用中性樹膠封蓋。如果脫水不徹底,封片后呈白色霧狀,鏡下觀察模糊不清,且容易褪色。切片1-2級無水乙醇脫水,也可使用石碳酸二甲苯進行脫水。石碳酸有較強脫水能力,但長時間可使切片脫色,因此要經過多次二甲苯以使石碳酸完全除去。
5.H-E染色評定標準:
(1)切片完整,厚度4-6微米,厚薄均勻,無皺褶無刀痕;
(2)染色核漿分明,紅藍適度,透明潔凈,封裱美觀。
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